갑상선 과산화 효소 활성은 아미노산에 의해 억제됩니다.
DP Carvalho, ACF Ferreira, SM Coelho, JM Moraes, MAS Camacho 및 D. Rosenthal
Laboratório de Fisiologia Endócrina, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
요약
정상 체외 갑상선 과산화효소(TPO) 요오드화 산화 활성은 가수 분해 TPO 준비(0.15mg/ml) 또는 가수 분해 소 세럼 알부민(BSA, 0.2mg/ml)에 의해 완전히 억제되었다.
카세인의 췌장 가수분해효소(trypticase peptone, 0.1mg/ml)와 일부 아미노산(cysteine, tryptophan, 메티오닌, 각 50µM)도 TPO 요오드화 산화 반응을 완전히 억제한 반면, 카사미노산(0.1mg/ml), 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘(tidine)은 각각 50µM)을 억제했다.
젤라틴(0.1mg/ml) 또는 기타 아미노산(50µM)의 췌장 소화가 TPO 활동을 유의하게 감소시키지 않았다.
요오드화 산화를 저해하는 아미노산도 TPO 알부민 요오드화 활동을 억제한다.
억제 아미노산은 황 원자(시스테인과 메티오닌) 또는 방향족 고리(티로신, 트립토판, 히스티딘, 페닐알라닌)가 있는 사이드 체인을 포함한다.
시험한 아미노산 중에서 시스틴만이 TPO 과이아콜 산화반응에 영향을 주어 25 µM 또는 50 µM에서 과도 억제를 생성하였다.
시스테인, 메티오닌, 트립토판 등의 요오드화 산화 억제 활성은 요오드화합물 농도를 12 mM에서 18 mM으로 증가시켜 역행한 반면, 공동 인자(H2O2) 농도를 증가시켰을 때 그러한 효과는 관찰되지 않았다.
억제 물질은 결합 부위의 정상 기판과 경쟁하여 자유 기판에 결합하거나 산화 형태를 감소시킴으로써 효소 활동을 방해할 수 있다.
키워드: 갑상선, 티로페록시디아제, 아미노산, 요오드화 산화제, 락토페록시디아제
소개
갑상선 과산화효소(TPO)는 갑상선 호르몬의 생합성(1,2)에 핵심적인 역할을 하는 헤메 함유, 막 결합, 당단백질 효소다.
요오드화물의 산화, 티로글로불린의 요오드화, 티로글로불린의 요오드화합물 잔류물의 결합은 TPO(2,3)에 의해 촉매화된다.
TPO 활성도는 다양한 인간 갑상선들에서 분석되어 왔으며, 대부분의 연구에서는 같은 분비선의 다른 부분들에서 효소를 추출했을 때(4)에도 불구하고 TPO 활성의 큰 변동성이 발견되었다.
호소야 외 연구진(5)은 앞서 정상 인간과 포신 갑상선 조직에서 발견되는 양호한 상관관계와는 달리 비정상적인 사이로이드에서 요오드화합물 산화 활성과 TPO 과이아콜 산화 활성 사이에 상관관계가 없어 보이는 점에 주의를 환기시킨 바 있다.
특성이 좋지 않은 TPO 억제제의 존재는 TPO (6-9)가 없거나 결함이 있기 때문에 일부 산발적이고 이호르몬 분비를 유발하는 고리에 앞서 설명되어 왔다.
이러한 결과는 호소야 외(5)에서 기술한 바와 같이 요오드화 산화 작용이 과이아콜 산화 작용에 영향을 미치지 않는 요인에 의해 영향을 받을 수 있다는 사실과 일치한다.
여기서 보고한 바와 같이 TPO 준비물과 소 혈청 알부민(BSA)의 효소 가수분해물과 일부 아미노산 및 펩타이드가 TPO 요오드 산화 억제제 역할을 할 수 있어 펩타이드 또는 일부 아미노산이 생체내 TPO 요오드 산화 및 요오드화 반응을 방해할 수 있음을 시사한다.
단, 시스테인을 제외하고 억제 아미노산은 TPO 과이아콜 산화반응을 억제하지 않는다.
재료 및 방법
확산 독성 고이터(DTG)와 정상 TPO 활성(NT)이 있는 결절 고이터의 편집성 조직으로부터 인간 갑상선 조직 검체를 갑상선 절제술에 의해 입수하여 즉시 냉동하여 추가 처리가 될 때까지 -20℃에서 보관하였다.
갑상선 조직은 섬유 조직과 석회화 또는 출혈 부위로 얼음으로 냉각된 유리판에 세척되었다. 갑상선 과산화효소는 앞에서 설명한 바와 같이 추출되었다(4,9). 간략히 갑상선 조직 검체를 세척하고 1mKI를 포함한 50mM Triis-HCl 버퍼 pH 7.2에 균질화하여 원심분리(10만 g, 4oC, 60분)하였다.
펠릿은 디지토닌(1%, w/v) 2ml에 매달려 48시간 동안 4oC에서 배양했다. 디지토닌 처리 서스펜션을 원심분리(10만 g, 4oC, 60분)하고 용해 TPO를 함유한 상등액을 활동 및 억제 측정 시 사용했다. 단백질 농도는 워버그와 크리스티안(10)의 방법으로 측정했다.
DTG-TPO 및 NT-TPO 요오드 산화 분석은 앞에서 설명한 바와 같이 과산화수소(H2O2) 발생 시스템으로 50 mM 인산염 버퍼, pH 7.4, 포도당-글루코스 산화효소 12 mM KI를 사용하여 수행되었다(4.9). 과이아콜 산화 분석의 경우, 호소야 외 연구진(5,9)이 기술한 방법의 사소한 수정이 사용되었다.
간단히 말해, 반응 혼합물에는 33 mM 과이콜(Aldrich Chemical Co., Milwoukey, WI, USA)이 들어 있었는데, 이것은 박사님의 친절한 선물이었다. Alvin Taurog, Southwest Medical School, UT, Dallas, TX, 미국) 50 mM 인산염 버퍼, pH 7.4, 포도당-글루코스 산화효소(H2O2 생성 시스템). 요오드 산화 분석(DA353)의 경우 353nm, 과이아콜 산화 분석(DA470)의 경우 470nm에서 흡광도 증가를 U-3300(히타치) 이중 빔 분광도계를 사용하여 모니터링했다.
TPO 활성도는 반응 곡선의 선형 부분에서 결정된 DA353/min 또는 DA470/min 비율에서 추정되었다. 요오드화(또는 과이아콜) 산화 활성의 한 단위는 DA353/min = 1.0(또는 DA470/min = 1.0)으로 정의된다. 특정 활동은 효소 조제 시 단백질 그램 당 요오드화합물(또는 과이아콜) 산화 활성의 단위로 정의되었다.
요오드화 TPO 활성도는 앞에서 설명한 바와 같이 660µg BSA(11)에 바인딩된 요오드의 BSA와 트리클로로아세트산(TCA) 침전물을 사용하여 결정되었다. 검사 혼합물에는 H2O2 발생 시스템으로 TPO, 660µg BSA, 30nmol 125I-iodide, 포도당-글루코스 산화효소가 포함되었으며, 50mM sodium phosphate buffer, pH 7.4로 최종 용적 1.0ml까지 구성되었다. 반응은 37oC에서 다른 기간 동안 수행되었고, 그 후 BSA는 10% TCA로 침전되었고 단백질에 결합된 총 요오드의 분율이 결정되었다.
단백질 제제는 프로나아제 1mg/ml(프로테마제 타입 XIV, 시그마 케미칼 주식회사, 세인트 루이스, MO, USA)로 37℃에서 90분간 가수분해 처리했다. 가수분해를 30분간 끓여서 중단시켰고, 비가수분해를 100℃에서 30분간 배양한 비가수분해제(부정 단백질)와 변성 프로나아제 용액(30분 동안 100℃)을 조정기로 사용했다.
요오드화 산화 억제 측정의 경우, 활성 DTG-TPO 또는 락토페록시디제(Sigma)의 동일한 요오드화 산화 활성(DA353/min)을 a)의 서로 다른 농도의 프로필티오르실(PTU) 또는 메티마졸(MMI); b) 0.4mg의 하이드로 분석하였다.paration 또는 그 제어; d) 카세인의 췌장 다이제스트 0.2mg(trypticase peptone, BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA) e) 젤라틴의 췌장 다이제스트 0.2mg(gelysate 펩톤, BBL); f) 카사미노산(디코, 디트로이트, MI, MI, USA) 0.2mg알 표준(Aldrich), 알라닌, 아스파르트산, 글리신 및 세린을 제외한다.
기질(요오드) 또는 효소 공동 인자(H2O2)와의 경쟁으로 인한 억제 가능성은 H2O2 발생(11mM 포도당 + 20µl 포도당 산화효소, 원래 5.5mM 포도당 + 10µl 포도당 산화효소) 또는 요오드화 농도를 증가시켜 평가하였다. 나아가 억제 아미노산이 H2O2, 4.0µM H2O2(Merck S.A, 리우데자네이루, RJ, 브라질)를 50~100%까지 TPO 요오드화 산화 활동을 억제하는 데 필요한 아미노산 농도의 유무에서 배양하였다. 튜브에 100µl의 아퀴팟을 전달하고 스코폴레틴(5µM)과 고추냉이페록시디제(5µg/ml)를 함유한 0.2M sodium phosphate buffer pH 7.8 1ml를 첨가했다. 형광은 앞에서 설명한 바와 같이 히타치(F4000) 분광기(흥분 = 360nm, 방출 = 460nm)로 측정했다. 형광 측정은 H2O2 농도에 대해 도표로 작성되었다.
결과.
DTG-TPO (1169 U/g 단백질)와 NT-TPO (431 U/g 단백질)의 요오드화 산화 특이 활성은 이전에 보고된 DTG 및 정상 조직 TPO 활동(4) 범위 내에 있었다. TPO 매개 티로글로불린 요오드화물의 50% 억제를 생성하는 데 필요한 PTU와 MMI의 농도는 각각 19.5 µM과 10 µM인 것으로 보고되었다.
우리의 실험 조건 하에서 우리는 TPO 요오드화합물 산화 반응에 대한 PTU(10µM)와 MMI(4µM)의 억제 효과에 대한 IC50 값에서 유사한 차이를 발견했다. 그러므로 우리의 TPO 검사 시스템은 적어도 잘 알려진 항응고제 PTU와 MMI에 대해서는 다른 저자들이 보고한 것과 비교할 수 있다.
DTG-TPO 요오드 산화 활성은 가수 분해 NT-TPO 또는 가수 분해 BSA에 의해 억제된 반면 프로톨리시스 이전에는 억제 활성이 존재하지 않았다. 실제로 비수화 NT-TPO를 끓이기 전에 첨가하면 원래 DTG-TPO 활동보다 71%가 증가했다. 변성(숙성) BSA 또는 NT-TPO 준비물은 원래 DTG-TPO 활동에 영향을 미치지 않았다(그림 1).
TPO 활동도 변성성 프로나아제의 첨가에는 영향을 받지 않았다.
DTG-TPO의 요오드화 산화 활성은 여러 펩타이드나 아미노산이 있는 상태에서 결정되었으며, 원래의 TPO 활성의 억제 정도는 그림 2와 같다. 젤라틴의 췌장 다이제스트는 TPO 활동을 크게 변화시키지 않았으며, 원래의 DTG-TPO 활동을 10% 이하로 억제하였다.
대조적으로, 카제인의 췌장소화는 DTG-TPO 활동을 완전히 폐지했다. 그럼에도 불구하고, 카세인(카사미노산)의 산 가수분해로부터 파생된 아미노산의 혼합물은 TPO 활성도를 부분적으로만 억제했다(54% 억제). 시험한 아미노산 중 시스테인(그림 3A), 메티오닌, 트립토판만이 50µM 농도에서 TPO 요오드화합물을 완전히 억제했다.
티로신(50µM)은 부분 억제(47%), 페닐알라닌(50µM)과 히스티딘(50µM)은 고농도(100µM)에서도 20~25%의 최대 억제 효과를 냈다.
원래 TPO 요오드 산화 활성(IC50)의 50%를 억제하는 데 필요한 억제 아미노산 농도는 12.5µM 시스테인, 13µM 메티오닌, 9.7µM 트립토판이었다. 다른 아미노산은 요오드화합물 산화 효소를 변화시키지 않았다.
락토페록시디아제(LPO)의 요오드화 산화 활성은 TPO-분석 반응을 억제하는 동일한 아미노산에 의해 억제되었고, 유사한 범위(데이터는 표시되지 않음)까지 억제되었다.
 | 그림 1-가수 분해 된 단백질이 DTG-TPO (diffuse toxic goiter-thyroid peroxidase) 요오드화물 산화 활성에 미치는 영향. TPO 요오드화물 산화 활성은 가수 분해되지 않은 (-) 또는 프로 나제 가수 분해 된 (+) 소 혈청 알부민 (BSA, 0.4mg) 또는 일반 TPO (NT, 0.3mg) 제제의 존재에서 측정되었습니다. 고정 요오드화 산화 활성 제조 TPO 용해 량 ( D 내지 353 / 분 = 0.1)은 각 실험 조건에 대해 분석 하였다. nd = 활동을 감지 할 수 없습니다. |
 | 그림 2-요오드화물 산화 억제 분석. 동일한 요오드화 산화 활성 ( D 353 nm의 활성 확산 독성 갑상선종 갑상선 과산화 효소 (DTG-TPO)의 / 분 = 0.1), 또는 췌장 젤라틴 0.2 mg을 소화하지 않고 분석 하였다 카사 미노산 0.2 ㎎, 췌장 0.2 mg의 카제인 다이제스트 또는 50 µM L- 아미노산. nd = 활동을 감지 할 수 없습니다. |
 | 그림 3-확산 독성 갑상선종-갑상선 과산화 효소 (DTG-TPO) 억제 분석. a) DTG-TPO, b) DTG-TPO + 시스틴 및 c) DTG-TPO + 시스테인의 요오드화 산화 (A) 또는 구 아이 아콜 산화 (B) 활성. DTG-TPO 요오드화 또는 guaiacol 산화 분석은 시스틴 (50μM) 또는 시스테인 (50μM)의 부재 또는 존재하에 수행되었습니다. |
과이아콜 산화 반응은 시스테인이 생성하는 매우 현저한 시차를 제외하고는 아미노산의 영향을 크게 받지 않았다(그림 3B).
이 시차는 시스틴 농도가 감소(25µM)되거나 효소의 농도가 2배 증가했을 때 감소하였다(데이터는 표시되지 않음). 시스틴과 대조적으로, 시스틴은 요오드화 산화나 과이아콜 산화 TPO 활동을 유의하게 변경하지 않았다(그림 3A 및 B).
반응 혼합물에서 H2O2의 증가가 아미노산에 의한 TPO 요오드화합물 산화억제의 비율을 바꾸지 않았다.
게다가, 어떤 억제 아미노산도 체외에서 H2O2를 파낼 수 없었다. 그러나 요오드화물의 양을 18 mM으로 늘렸을 때 카사미노산, 티로신, 페닐알라닌 또는 히스티딘에 의해 생성되는 억제가 감소하여 요오드화 산화 활성도가 10~25% 증가하였다. 요오드화물의 동일한 증가는 50µM 사이스테인, 트립토판, 메티오닌에 의해 촉진되는 강한 억제를 바꾸지 않았다.
그럼에도 불구하고, 이러한 강한 억제는 분석의 아미노산 농도에 의존했다. 키네틱 요오드화 산화 연구 결과, 더 높은 요오드화 농도에서 원래 억제력이 역전되기 때문에 시스테인(12.5µM), 메티오닌(13µM) 또는 트립토판(9.7µM)에 의해 생성된 억제 효과가 되돌릴 수 있었고, 요오드화 효소 K0.5는 이러한 아미노산이 있는 상태에서 크게 증가하여 경쟁력을 나타냈다.적어도 시험 농도(표 1)에서 반작용의 히비션.
DTG-TPO 요오드화 활성도 TPO 요오드화 산화 반응을 억제하는 모든 아미노산에 의해 억제되었지만 억제 패턴은 달랐다. 요오드화 산화 반응 트립토판과 시스테인은 K0.5(표 1)의 등가 증가와 함께 가장 강력한 억제제였지만, 요오드화 반응을 억제하는 데는 트립토판보다 시스테인이 더 강력했다(그림 4). 타이로신 역시 요오드화 반응을 억제했지만, 50µM 페닐알라닌, 히스티딘, 프롤라인 또는 낭스틴은 요오드화 활동을 억제하지 않았다.
 | 그림 4-확산 독성 갑상선종-갑상선 과산화 효소 (DTG-TPO) 요오드화 활성에 대한 일부 아미노산 (50μM)의 효과. DTG-TPO에 의한 소 혈청 알부민 (BSA)의 요오드화는 티로신 (열린 사각형), 트립토판 (채워진 사각형), 메티오닌 (삼각형) 또는 시스테인 (원)의 부재 또는 존재하에 측정되었습니다. |
토론
소와 난자 갑상선 균질체의 수용성분에서 TPO 요오드화 활성의 내생성 투석 억제제의 존재는 60년대(13,14년)에 수행된 연구에서 처음 보고되었는데, 이는 글루타티온과 같은 내생성 황하이드릴 함유 화합물이 적어도 부분적으로 요오드화 흡입에 책임이 있음을 시사했다.
입욕의 아스코르브산, 시스테인, 에피네프린, 노레피네프린, 세로토닌, NADH, NADPH 등이 티로신 요오드화(13)를 억제할 수 있다는 사실도 밝혀졌다.
더 최근의 연구는 식이 요법 플라보노이드와 설파메타진 같은 일부 외생성 물질이 최소한 체외(15-17)에서 TPO 활동을 손상시킬 수 있다는 것을 보여주었다.
여기에 나타난 바와 같이 BSA의 효소 단백질 분해, 그리고 TPO 조제에도 TPO 억제제가 방출되었다.
또한, 카제인의 췌장 소화제(그러나 젤라틴은 아님)와 카제인의 산 가수분해로부터 파생된 아미노산의 혼합물은 시험관내 TPO 활동을 현저하게 손상시킬 수 있었으며, 이는 이들 혼합물의 성분인 일부 아미노산이 TPO 억제를 책임질 수 있음을 시사한다.
젤라틴의 췌장 소화가 TPO 요오드화합물 산화반응을 바꿀 수 없었으므로 아마도 다른 콜라겐의 1차 구조(18)에서 예상한 바와 같이 소량의 특정 TPO 억제 아미노산 잔류물만을 함유하고 있을 것이다.
시험관내 TPO 활동을 저해하는 아미노산은 황 원자(시스테인과 메티오닌)가 있는 사이드 체인이나 방향족 고리(티로신과 트립토판)를 함유하고 있는 것을 발견했다. 그러나 TPO 억제 정도는 억제 아미노산 사이에서 상당히 다르다.
이번 연구결과는 시스틴 이외의 아미노산이 요오드 산화물과 요오드화합물 활동을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
그러나 시스테인은 요오드화 반응의 가장 강력한 억제제였으며, 가이아콜 산화 억제는 자가 제한적이었지만 요오드화 및 과이아콜 산화 활동을 모두 억제하는 유일한 아미노산이었다.
티우레일렌 약물의 농도(1)에 따라 TPO 요오드화 반응의 일시적 억제도 설명되었다.
또한 티우레일렌 약물의 억제 효과에 대해서도 타우록(1)에서 알 수 있듯이, 시스틴, 메티오닌, 트립토판 등이 생성하는 요오드화 산화 억제 정도는 요오드화 농도에 따라 달라지는 것으로 보인다.
따라서, 이러한 아미노산에 의한 TPO 억제 메커니즘은 타우록(1)이 제안한 티우레일렌 약물과 유사한 것으로 보일 것이다.
이 저자가 제안한 바와 같이, 요오드화물의 산화 형태는 티우레일렌 약물과 요오드화 타이로신 잔류물에도 영향을 미칠 수 있으므로, 티우레일렌은 산화 요오드화물에 대한 티로실 잔류물과 경쟁하여 요오드화 반응을 억제할 수 있다.
일부 저자들은 또한 효소의 불활성화 자살, 급속 평형 결합, 요오드화 중간(15)을 위한 대체 기질 경쟁과 같은 TPO와 LPO-catalysty reaction의 억제에 대해 여러 메커니즘이 책임을 질 수 있다는 것을 증명했다.
따라서 적어도 과이아콜 산화 분석의 조건하에서는 티우레일렌에 제안된 것처럼 시스테인이 시스틴과 같은 비침습적 형태로 산화될 수 있다고 추측하는 것이 유혹적이다.
과이아콜 산화는 트립토판과 메티오닌에 의해 억제되지 않았으며, 이는 이러한 아미노산이 과이아콜의 산화 형태와 상호 작용하지 않음을 나타낸다.
그러나 트립토판과 메티오닌은 시스테인과 마찬가지로 요오드 산화 반응의 경쟁적 억제제인 것처럼 보이며, 따라서 우리가 시스테인을 제안하는 것처럼 요오드화물의 산화 형태와 반응하거나 TPO의 부지에 대해 요오드화 이온과 역행적으로 경쟁할 수 있다.
결론적으로, 우리의 연구 결과는 일부 아미노산의 시험관내 과산화효소 활성의 억제가 요오드화물의 산화 형태 및/또는 TPO 분자의 요오드화합물 부위와의 상호작용에 의해 생성될 수 있다는 것을 보여준다. 갑상선 조절에서 아미노산에 대한 가능한 생리학적 역할을 정의하기 위한 추가 연구가 필요하다.
